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アントラニル酸による誘導体化と蛍光検出に基づく、グリコシルトランスフェラーゼの新しい高速液体クロマトグラフィー アッセイ。

高性能液体によるβ1-4 ガラクトシルトランスフェラーゼ (GalT-1) とα2-6 シアル酸転移酵素 (ST-6) の両方の活性を測定するためのアッセイが、2-アミノ安息香酸 (2AA; アントラニル酸、AA) の独自の標識化学を使用して開発されました。蛍光検出を伴うクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（Anumula KR. 2006. Advances in fluorescent derivatization Methods for high-performance liquid chromatography of glycoprotein炭水化物s. Anal Biochem. 350:1-23）。GalT-1 と ST-6 のアクセプターとして N-アセチルグルコサミン (GlcNAc) と N-アセチルラクトサミンを、供与体としてウリジン二リン酸 (UDP)-ガラクトースとシチジン一リン酸 (CMP)-N-アセチルノイラミン酸 (NANA) をそれぞれ使用しました。酵素生成物はその場でAAで標識され、順相条件を使用してTSKgel Amide 80カラムで基質から分離されました。酵素単位は、同時に誘導体化された標準 Gal-β1-4GlcNAc および NANA-α2-6 Gal-β1-4GlcNAc との比較により、ピーク面積から決定されました。アッセイの直線性 (時間および酵素濃度)、精度 (アッセイ内およびアッセイ間)、および再現性が確立されました。このアッセイは、単離および精製中の酵素活性のモニタリングに有用であることが判明しました。このアッセイは感度が高く、従来の放射性糖ベースの測定と同等以上の性能を発揮しました。このアッセイ形式は、炭水化物アクセプターに標識用の還元末端が含まれている場合に限り、他のトランスフェラーゼの活性を測定するために使用することもできます。IgG を使用した糖タンパク質アクセプターのアッセイが開発されました。IgG グリカン (二分岐 G0、G1、G2、モノシアル化およびジシアル化) を分離するための短い HPLC プロファイリング法が開発されました。これにより、GalT-1 および ST-6 活性の迅速な測定が容易になりました。さらに、このプロファイリング方法は、臨床現場で IgG グリカンの変化をモニタリングするのに役立つことが証明されるはずです。