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微生物宿主の代謝を理解することは、生産効率を左右するため、全細胞ベースの生体触媒プロセスの開発と最適化に不可欠です。これは、宿主に内因性の補因子/補基質の再生能力があるため、代謝的に活性な細胞が使用される酸化還元生体触媒に特に当てはまります。組換え大腸菌は、共基質としてα-ケトグルタル酸 (a-KG) を用いて遊離 L-プロリンからトランス-4-ヒドロキシ-L-プロリンへの水酸化を触媒するジオキシゲナーゼであるプロリン-4-ヒドロキシラーゼ (P4H) を過剰生産するために使用されました。この全細胞生体触媒では、中心炭素代謝が必要な共基質 a-KG を提供し、P4H 生体触媒性能を炭素代謝および代謝活性に直接結合させます。代謝工学や 13 C-代謝フラックス解析 ( 13 C-MFA) などの実験生物学ツールと計算生物学ツールの両方を適用することにより、全細胞生体触媒の生理学的、代謝的、生体エネルギー的応答を調査し、定量的に説明しました。プロリンデヒドロゲナーゼをコードする putA 遺伝子を欠失させることにより、プロリン分解欠損大腸菌株を構築しました。この変異株による全細胞生体内変換により、定量的なプロリン水酸化だけでなく、野生型と比較して特異的なトランス-4-L-ヒドロキシプロリン (hyp) 形成速度が 2 倍になりました。変異株の中枢代謝による炭素フラックスの分析により、P4H活性に対するa-KG要求の増加はa-KG生成フラックスを強化しないことが明らかになり、研究した条件下でTCAサイクルの作動が厳密に制御されていることを示した。野生型株では、P4H 合成と触媒作用によりバイオマス収量の減少が引き起こされました。興味深いことに、ΔputA 株は、TCA 活性を増加させる代わりに、比較的低いグルコース取り込み速度で維持エネルギー要求量を削減することによって、関連する ATP と NADH の損失をさらに補いました。 組換え大腸菌 BL21(DE3)(pLysS) における putA ノックアウトは、生体内変換収率だけでなく、生体内変換とプロリンの取り込み速度、およびエネルギー源での hyp の収率に関しても、生産的な P4H 触媒作用に有望です。この結果は、putA ノックアウトの際、共基質 a-KG を介したプロリン水酸化への TCA サイクルの共役が、α-KG 依存性生体内変換の効率をさらに向上させるための重要な制約因子および標的となることを示しています。