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同時変異の影響がどのように組み合わされて酵素活性が変化するかは、これらの影響が必ずしも直線的に相加的であるとは限らないため、簡単に予測することはできません。したがって、基質に結合するアミノ酸残基の同時変異の影響を特徴付けることは、酵素の基質特異性の理解に大きく貢献する可能性があります。Spodoptera fragiperda (Sfbetagly) のベータグリコシダーゼでは、残基 Q39 と E451 の両方が基質と相互作用し、これは基質特異性を定義するために不可欠です。Sfbetagly の二重変異体 (A451E39、S451E39 および S451N39) を部位特異的突然変異誘発によって調製し、細菌で発現させ、アフィニティークロマトグラフィーを使用して精製しました。これらの酵素は、基質として p-ニトロフェニル ベータ-ガラクトシドおよび p-ニトロフェニル ベータ-フコシドを使用して特性評価されました。Q39 および E451 位に部位特異的変異を含む Sfbetagly の単一および二重変異体の k cat/Km 比を使用して、二重変異 (Gdouble) の ESdouble ダガー (酵素遷移状態複合体) の自由エネルギーに対する影響が実証されました。 daggerxy) は、単一の突然変異 (Gdouble daggerx と Gdouble daggery) から生じる効果の合計ではありません。Gdouble ダガーの​​この違いは、単一の突然変異の効果が部分的に重複していることを示しています。したがって、このコモン効果は Gdouble daggerxy で 1 回のみカウントされます。ベータ-グリコシダーゼの結晶学的データは、残基 Q39 および E451 と基質の同じヒドロキシル基を含む二座水素結合の存在を明らかにしています。したがって、熱力学的データと結晶学的データの両方は、残基 Q39 および E451 が基質とのそれぞれの相互作用に相互影響を及ぼしていることを示唆しています。